細胞SGK1激(ji)酶(mei)活(huo)性(xing)光度法定量檢測試劑(ji)盒產品(pin)說明書（中文版(ban)）

主要用(yong)途

  細胞SGK1激酶(mei)活(huo)性(xing)光度法定量檢測試(shi)劑是(shi)一種旨在(zai)通過多肽(tai)底物，在敏感性(xing)抑制劑存在與否的情況下，受到SGK1磷(lin)酸(suan)化(hua)后，進(jin)而由(you)丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶(mei)連續循環法反應系統，測定產生ADP過程(cheng)中(zhong)，伴隨的(de)還原(yuan)型(xing)煙酰胺(an)腺(xian)嘌呤二核苷(gan)酸（NADH）的氧化反應， 即采用光(guang)度(du)法(fa)測(ce)定其氧(yang)化后峰值的變化，以分析細胞裂(lie)解(jie)樣品中SGK1活性的而(er)經典的技(ji)術方法。該技(ji)術經過精心研(yan)制、成功實(shi)驗證明的。其適用(yong)于各(ge)種細胞裂解萃取液樣(yang)品(pin)（動(dong)物、人體(ti)）、部分或(huo)純(chun)化酶樣(yang)品(pin)中SGK1激酶的(de)(de)定(ding)量檢測，以及(ji)抑制劑(ji)和激(ji)活劑(ji)的(de)(de)篩選。產(chan)品嚴格無菌，即到(dao)即用，操作簡捷，性能穩定，高度(du)敏感。

技術(shu)背景

血清(qing)和糖(tang)皮(pi)質激素(su)調節蛋白激酶（Serum-glucocorticoid regulated kinase；SGK），是血清和糖皮質激素誘導(dao)性蛋白激酶家族成(cheng)員，屬于(yu)絲氨酸/蘇氨(an)酸激酶（serine/threonine protein kinase；EC2.7.11.1）家(jia)屬。其功(gong)能(neng)在于調節細胞(bao)信號(hao)通路、細胞(bao)繁殖和(he)存活、應(ying)激反應(ying)、離子（鈉、鉀和(he)鈣）轉運、腫瘤(liu)生長、轉移(yi)、自噬等(deng)。SGK有3種亞體：SGK1、SGK2和(he)SGK3。其中SGK1在所有(you)組織中表達，分布在細胞(bao)質中，屬于AGC亞型家族，結構和(he)功能上(shang)與AKT類似。SGK1由3-磷酸(suan)肌醇依賴性蛋(dan)白激酶-1（PDK1）體外激(ji)活(huo)，并在體內對于磷脂酰肌(ji)醇(chun)3-激酶活(huo)化產生的信號(hao)作出應(ying)答(da)。通(tong)過(guo)使FKHRL1磷酸化(hua)和失活(huo)，促使(shi)細胞生存。血清和地塞米松刺激增(zeng)加SGK1的mRNA表達水平。SGK1和SGK3在PKB/AKT非依賴性磷(lin)酸肌醇(chun)3-激(ji)酶調理的腫(zhong)瘤(liu)生成中發揮(hui)作用，肺癌和(he)前(qian)列腺癌的SGK1水平(ping)增高(gao)，而乳腺癌(ai)的(de)SGK3水平增高，由此(ci)成為腫瘤治療(liao)的藥物靶(ba)標(biao)，以及預后(hou)指(zhi)標(biao)。SGK1與(yu)高血壓、糖尿(niao)病(bing)、炎(yan)癥、自身免疫(yi)疾病(bing)、血管生成、生命長度等相(xiang)關。其(qi)磷酸化目(mu)標序列為RPRAATF。基(ji)于底物RPRAATF，在ATP的參與下，同時在SGK1敏(min)感的抑制(zhi)劑EMD638683存在與否(fou)的情(qing)況下(xia)，受到SGK1激酶的磷酸化，獲(huo)得(de)產物磷酸化多肽(tai)，進(jin)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和(he)乳酸脫氫(qing)酶(mei)（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(suan)（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化(hua)為氧化(hua)型(xing)煙酰胺腺嘌呤(ling)二核(he)苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化(hua)（340nm），來定量(liang)分析SGK1激酶的特異(yi)活性(xing)。其反應(ying)方式為：

產品內容

  清理(li)液（Reagent A）         毫升

  裂解液(ye)（Reagent B）         毫升(sheng)

  緩(huan)沖液（Reagent C）          毫(hao)升

  酶促液（Reagent D）          毫(hao)升

  反應液（Reagent E）         毫升(sheng)

  底物液（Reagent F）        毫升

  陰性液（Reagent G）         微升

  專性(xing)液（Reagent H）         微(wei)升

產品說明(ming)書(shu)              1份(fen)

保存方(fang)式

保存  清理液(ye)（Reagent A）在(zai)4℃冰箱里；其(qi)余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避(bi)免光照和反復(fu)凍融；有(you)效保證6月(yue)

用戶自備

SGK1激酶(mei)：用(yong)于抑制劑篩選

1.5毫升離心(xin)管：用于樣品操作和(he)保存的容(rong)器

15毫升(sheng)錐形離心管：用于樣品處(chu)理的容器

細(xi)胞刮脫(tuo)棒：用于貼壁細(xi)胞脫(tuo)離

（微型）臺式(shi)離(li)心(xin)機：用于(yu)細(xi)胞(bao)預處理

200微升1厘(li)米光(guang)徑比色(se)皿或96孔板：用于光(guang)度分析操(cao)作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一(yi)、 待測樣品(pin)準備

1． 準(zhun)備好75cm²細胞培(pei)養瓶或(huo)100mm細胞培(pei)(pei)養(yang)皿的待測培(pei)(pei)養(yang)細胞（1至5 X 10⁷細(xi)胞）

2． 小心加(jia)入xx毫(hao)升  清理(li)液（Reagent A），覆(fu)蓋(gai)生長表面(mian)

3． 小(xiao)心抽(chou)去(qu)清理液

4． 使用細胞刮(gua)脫棒輕柔刮(gua)脫細胞（注(zhu)意：避免使用胰(yi)酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液(ye)（Reagent A），混勻細胞

6． 移(yi)入到預冷的15毫(hao)升錐形離心管（注意：懸浮細胞(bao)從這一步(bu)驟開(kai)始）

7． 放進4℃臺式離心(xin)機離心(xin)5分鐘，速度為300g

8． 小(xiao)心(xin)抽去上清液(ye)

9． 加入xx至xx微升  裂解液（Reagent B），充分混(hun)勻(yun)（注(zhu)意：可以調節蛋白濃度）

10． 轉(zhuan)移到預冷(leng)的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋(xuan)震蕩15秒

12． 置于冰槽(cao)里(li)孵育(yu)30分(fen)鐘

13． 放進4℃微(wei)型(xing)臺式離心機離心5分鐘，速度(du)為16000g（或13000RPM，例(li)如(ru)eppendorf 5415）

14． 小心移取(qu)100至500微升上清液到新的預冷的1.5毫升(sheng)離心管(guan)

15． 移取10微(wei)升進(jin)行蛋白(bai)定量檢(jian)測（注意：建議使用   Bradford蛋白(bai)質濃度定量(liang)試劑(ji)盒－GMS30030.1）

16． 即(ji)刻放進－70℃保存或置于冰(bing)槽里繼續后續操作(zuo)

二、 測定準備(bei)

1． 準備好待測(ce)樣品（例(li)如細(xi)胞裂解懸(xuan)液等），置于冰槽里 

2． 設定好分(fen)光光度儀(yi)（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shu)6次（共(gong)5分鐘），并(bing)置零

3．   緩沖(chong)液(ye)（Reagent C）室(shi)溫下均(jun)衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升  緩(huan)沖液（Reagent C）到(dao)新(xin)的(de)比色皿

2． 加入xx微升  酶促液(ye)（Reagent D）

3． 加入xx微升  反應液（Reagent E）

4． 加(jia)入xx微升  底物液（Reagent F）

5． 放進(jin)30℃培(pei)養箱里(li)靜置3分鐘

6． 加入xx微升  陰性(xing)液（Reagent G）

7． 上(shang)下(xia)傾倒(dao)數次，混(hun)勻（限定在3秒之內）

8． 即(ji)刻(ke)放進分光光度儀檢測，此為(wei)背景空對(dui)照：340波長讀(du)數0分鐘(zhong) －340波長讀數5分鐘 

四、 樣(yang)品總活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比(bi)色皿

2． 加入xx微升  酶(mei)促液(ye)（Reagent D）

3． 加入xx微(wei)升  反應液（Reagent E）

4． 加(jia)入xx微升  底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養箱(xiang)里靜置(zhi)3分鐘

6． 加入10微升待(dai)測樣品（注意(yi)：100微克細胞裂解蛋白；樣(yang)品須溶解）

7． 上下傾倒數次，混勻(yun)（限定在3秒(miao)之(zhi)內）

8． 即刻(ke)放進分(fen)光光度儀檢(jian)測，此為樣品總活性讀(du)數：340波長讀(du)數(shu)0分鐘 －340波(bo)長讀數5分鐘 

五、 樣品(pin)非特異(yi)活性測定

檢測開(kai)始前，移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心(xin)管，分別加入xx微升  專(zhuan)性液（Reagent H）和待(dai)測(ce)樣品(pin)（注意：100微克(ke)細胞裂解蛋白），混(hun)勻后，放(fang)進(jin)30℃培養箱(xiang)里孵育30分鐘。然后繼續下列操作。

1． 移取xx微(wei)升  緩沖液（Reagent C）到(dao)新的比色皿

2． 加入xx微升  酶促(cu)液（Reagent D）

3． 加入(ru)xx微升  反(fan)應液（Reagent E）

4． 加入xx微升  底物液(ye)（Reagent F） 

5． 放進(jin)30℃培養(yang)箱里靜置3分鐘(zhong)

6． 加入40微升上述(shu)預處理的待測樣品

7． 上下傾(qing)倒數次，混(hun)勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光(guang)光(guang)度儀檢測，此為樣(yang)品非特(te)異活性讀(du)數：340波長讀數0分(fen)鐘 －340波(bo)長讀數5分鐘

六、 計算樣(yang)品(pin)活性

1） 樣(yang)品(pin)總活性和非(fei)特異活性計算

2）樣品特異活性計算(suan)

六、酶標儀測(ce)定

1）樣(yang)品(pin)總活性測定

1． 在96孔板上做(zuo)好相(xiang)應標記：背景(jing)對照和(he)樣品

2． 分別移取xx微(wei)升  緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加(jia)入xx微升  酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微(wei)升(sheng)  反應液（Reagent E）

5． 分別(bie)加入xx微升(sheng)  底物(wu)液（Reagent F）

6． 輕(qing)輕(qing)搖動(dong)96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘(zhong)

8． 分別(bie)加(jia)入(ru)xx微升(sheng)  陰性液(ye)（Reagent G）或(huo)待測樣品（100微克細胞裂解(jie)懸液蛋(dan)白(bai)）到相應(ying)孔里（注意：樣品須(xu)清(qing)澈）

9． 輕輕搖動(dong)96孔板

10． 即刻(ke)放進酶標(biao)儀檢測：0分鐘讀數和(he)5分鐘讀數(shu)

11． 活性計算：

2） 樣品非(fei)特異活性(xing)測定(ding)

檢測開始前，移取xx微升(sheng)  緩(huan)沖液(ye)（Reagent C）到1.5毫(hao)升(sheng)離(li)心管，分別(bie)加入xx微升(sheng)  專性液（Reagent H）和待(dai)測樣品（注(zhu)意：100微克細胞裂解(jie)蛋白），混(hun)勻后，放(fang)進30℃培養箱里孵育30分鐘。然后繼續下列操作。

1． 在96孔(kong)板上做好相應(ying)標(biao)記：待測樣品

2． 移取xx微(wei)升  緩沖(chong)液（Reagent C）到96孔板里

3． 加(jia)入xx微升(sheng)  酶促液(ye)（Reagent D）

4． 加入xx微升  反應液(ye)（Reagent E）

5． 加入xx微升  底物液(ye)（Reagent F） 

6． 輕(qing)輕(qing)搖動(dong)96孔(kong)板(ban)

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘(zhong)

8． 加入(ru)40微升上述預處理的待測樣品

9． 輕輕搖動96孔板

10． 即刻放進(jin)酶標儀檢測：0分鐘讀數(shu)和5分鐘讀數

11． 活性計(ji)算：

3） 樣品特異活性計算(suan)

七、抑(yi)制劑篩選

1． 在96孔板上做好相(xiang)應(ying)標記：背景(jing)、活性和待測抑制劑樣品(pin)

2． 按下表加入試劑(ji)，進行樣(yang)品預處(chu)理(li)

3． 分別(bie)移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到(dao)新的96孔板的所有孔里

4． 分(fen)別加入xx微(wei)升  酶促(cu)液（Reagent D）

5． 分別加入(ru)xx微(wei)升  反應液(ye)（Reagent E）

6． 分別(bie)加入(ru)xx微升  底(di)物液（Reagent F） 

7． 輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)搖動96孔板

8． 在(zai)30℃溫度下(xia)孵育3分鐘

9． 加入(ru)40微升上述預處理(li)的待(dai)測樣(yang)品(pin)

10． 即刻(ke)放進(jin)30℃酶(mei)標儀檢測(ce)：測讀30分鐘(zhong)

11． 抑制活性計算：

注意事項(xiang)

1． 本產(chan)品為20次操作

2． 操作時，須戴(dai)手套

3． 系(xi)統(tong)操作過(guo)程中，背景測定只需(xu)1次

4． 樣品處理忌用(yong)磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關重要 

6． 加入樣品啟動(dong)反應后3秒內即刻光度測定

7． 建(jian)議使用比色(se)皿測定(ding)

8． 測定值由高(gao)到低變(bian)化；測定可持續(xu)30分鐘

9． 光度(du)測定后，比(bi)色皿須清洗

10． 樣本測定0分(fen)鐘讀(du)數高于(yu)5分鐘讀數(shu)表明具有酶活性

11． 樣(yang)本測定讀數持續上升，表(biao)明酶活過(guo)(guo)低或樣(yang)品量過(guo)(guo)低

12． 非特(te)異(yi)(yi)活性(xing)高于總活性(xing)，表明特(te)異(yi)(yi)性(xing)酶(mei)活過低(di)或樣(yang)品量過低(di)

13． 建(jian)議(yi)待測(ce)樣本蛋(dan)白濃度為100微克/10微升（本公(gong)司提供    Bradford蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度(du)定量試劑盒(he)－GMS30030.1）

14． 如果待測樣品(pin)(pin)濃(nong)度過高或過低，可以(yi)調整(zheng)樣品(pin)(pin)濃(nong)度

15． SGK1激酶活性(xing)單位濃度(du)定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微(wei)摩爾還原型煙酰胺(an)腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一(yi)個活性(xing)單(dan)位

16． 本公司提供系列蛋(dan)白激酶(mei)檢測試劑產品

質量標(biao)準

1． 本(ben)產品(pin)經(jing)鑒定性(xing)能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感