每個進口ELISA試劑盒價格都不貴，但是如果使用不恰當的話，造成檢測結果出差錯還是不好的。所以在使用ELISA試劑盒檢測的時候，步驟的準確性真的是相當重要的。以下先介紹一種簡單的—間接法：1.用包(bao)被(bei)緩沖液將已知抗原稀(xi)釋(shi)至1～10μg/ml，每孔(kong)加0.1ml，4℃;
2.次日(ri)洗滌3次;
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知(zhi)抗體(ti))0.1ml于上述已包(bao)被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;
4.(同(tong)時(shi)做空白(bai)、陰性及陽性孔對(dui)照)于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分(fen)鐘(zhong)，洗滌;
6.后(hou)一遍用DDW洗滌。
7.加(jia)底物液(ye)顯色(se)(se)：于(yu)(yu)各(ge)(ge)反(fan)應(ying)孔(kong)中(zhong)加(jia)入臨時(shi)配制(zhi)的(de)TMB底物溶(rong)液(ye)0.1ml，37℃10～30分鐘。 8.終止反(fan)應(ying)：于(yu)(yu)各(ge)(ge)反(fan)應(ying)孔(kong)中(zhong)加(jia)入2M硫酸(suan)0.05ml。 9.結果(guo)判(pan)定：可(ke)于(yu)(yu)白(bai)色(se)(se)背(bei)景上，直接(jie)用肉眼觀察結果(guo)：反(fan)應(ying)孔(kong)內顏(yan)色(se)(se)越(yue)深(shen)，陽性(xing)(xing)程度(du)越(yue)強，陰性(xing)(xing)反(fan)應(ying)為無色(se)(se)或極淺，依據所呈(cheng)顏(yan)色(se)(se)的(de)深(shen)淺，以(yi)“+"、“-"號(hao)表示。也可(ke)測(ce)OD值(zhi)：在ELISA檢測(ce)儀上，于(yu)(yu)450nm(若(ruo)以(yi)ABTS顯色(se)(se)，則(ze)410nm)處，以(yi)空白(bai)對照(zhao)孔(kong)調零(ling)后測(ce)各(ge)(ge)孔(kong)OD值(zhi)，若(ruo)大(da)于(yu)(yu)規(gui)定的(de)陰性(xing)(xing)對照(zhao)OD值(zhi)的(de)2.1倍，即為陽性(xing)(xing)。
注意事項(xiang)
1.試(shi)(shi)劑(ji)準備：所(suo)有試(shi)(shi)劑(ji)都必須在使用前(qian)達(da)到室溫(wen)，使用后請立即按照說明(ming)書要(yao)求保存。實驗操作中必須使用一次(ci)性吸頭，避免交(jiao)叉污染。
2．加(jia)樣(yang)：加(jia)樣(yang)時，要(yao)控(kong)制加(jia)樣(yang)速度，避(bi)免*孔與(yu)zui后一(yi)孔之見的時間間隔過大，否則將會導致(zhi)不同的預孵育時間，從(cong)而影響實(shi)驗的準確性以及重(zhong)復性；一(yi)般加(jia)樣(yang)時間控(kong)制在10分(fen)鐘內，如果樣(yang)本數量過多，可使用多道移液器。
3.孵(fu)育：樣品要在(zai)密(mi)閉的容器內(nei)進行孵(fu)育，嚴格按照說(shuo)明書上規定(ding)的孵(fu)育時間和溫度進行。
4.洗(xi)滌(di)：洗(xi)滌(di)過(guo)程中反應(ying)孔中的(de)殘留的(de)洗(xi)滌(di)液(ye)應(ying)在濾(lv)紙上充分(fen)拍干，同時要(yao)消(xiao)除板底殘留的(de)液(ye)體和(he)手指痕跡(ji)，避免影響(xiang)zui后的(de)酶標(biao)儀讀(du)數。
5.反應(ying)時間(jian)的控制：加入(ru)底物后請定時觀察(cha)反應(ying)孔的顏色變化(hua)（比如，10分鐘(zhong)左(zuo)右），如果顏色較深，請提(ti)前加入(ru)終止液終止反應(ying)。
6.建議實(shi)驗前樣品(pin)(pin)含(han)量，如樣品(pin)(pin)濃度過(guo)高(gao)，應(ying)對樣品(pin)(pin)進行稀(xi)釋，計算結(jie)果時乘以(yi)相(xiang)應(ying)的稀(xi)釋倍數。
7.建議使用本試(shi)劑盒(he)時先(xian)做(zuo)預實驗(yan)（即先(xian)做(zuo)標(biao)準曲線，試(shi)用幾個標(biao)本），如果(guo)對本試(shi)劑盒(he)有任何疑問，可和所購經(jing)銷(xiao)商，如果(guo)因運輸過程(cheng)導致試(shi)劑盒(he)失效，可要求調(diao)換，但概(gai)不承擔產品本身(shen)以(yi)外(wai)的任何損失。
